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  • 巖藻糖敲除宿主細胞株(CHO-K1-TGZ)在抗體藥物生產的應用

    2022-06-09

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    一、概述


    1986年美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準了首個單抗藥物。30多年來,抗體藥物領域的發展日新月異,到目前為止,FDA共批準了近百個治療性抗體藥物,主要用于治療癌癥、自身免疫性疾病、傳染病等多種疾病。在2021年全球藥品銷售TOP10排行榜上[1],抗體類藥物占5種,其全球銷售總額接近700億美元,治療性抗體已經成為目前制藥行業增長最快,盈利最大的產品之一。


    二、抗體抗腫瘤藥物發揮作用的基本機理

    治療性抗體中單抗的抗原結合片段(Fab)決定了抗體結合抗原的特異性和親和力;單抗的恒定區(Fc)通過結合細胞表面Fc受體(FcγRIIIa)來發揮抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)、補體依賴的細胞毒性作用(CDC)、抗體依賴的細胞吞噬作用(ADCP)等功能。在腫瘤治療中,單克隆抗體治療的核心仍是ADCC效應,體外研究已證明通過NK細胞等免疫效應細胞表達的FcγⅢa受體在單克隆抗體對抗惡性腫瘤細胞系的 ADCC中的重要作用。



    圖1. 抗體揮發作用的方式[2]




    抗體抗腫瘤藥物的銷售市場廣闊。據最新藥品銷售數據,2021年銷售額排第一的K藥(Keytruda)銷售額達到171.8億美元,近年來,Keytruda的適應癥仍不斷擴大,目前在全球獲批的適應癥超30項,包括黑色素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、結直腸癌、宮頸癌等;排第二的O藥(Opdivo)則是全球首個獲批的PD-1抑制劑。自2014年7月獲批以來,Opdivo已在60多個國家和地區獲批治療10余個癌種,涵蓋肺癌、頭頸癌、胃癌、食管癌、肝癌、腎癌、結直腸癌等。2021年TOP 10腫瘤單抗藥的全球銷售總額超過430億美元,其中1997年上市的利妥昔單抗,銷售額仍達到27.7美金,可見抗體抗腫瘤藥物的巨大市場和強大的生命力。2021年腫瘤單抗藥全球銷售額TOP 10榜單見下圖:


    表1. 2021年全球TOP10抗腫瘤單抗銷售額


    根據國內2021年抗腫瘤市場前三季度藥品銷售數據,在TOP 10產品中,包含4款生物藥,這四款單抗產品分別為貝伐珠單抗、曲妥珠單抗、利妥昔單抗、帕妥珠單抗[3]。其中曲妥珠單抗從基礎到臨床的諸多研究均已充分證實ADCC效應是其重要作用機制,巖藻糖敲除的曲妥珠單抗在體外活性和體內藥效學評價上都具有明顯的優勢,有望在不久的將來取代曲妥珠單抗[4]。


    三、ADCC與去巖藻糖

    細胞依賴的細胞毒性作用(ADCC)是通過自然殺傷細胞(NK細胞)的Fc受體(如FcγRIIIa)與已結合在靶細胞表面的IgG抗體的Fc段結合,進而活化,釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質直接殺傷靶細胞的作用。

    從上世紀90年代開始,臨床研究發現ADCC是治療性抗體(如抗Her2抗體[4,5]、抗CD20抗體[6-8])臨床療效的關鍵機制之一,對于抗體發揮療效至關重要。而抗體與Fc受體(如FcγRIIIa)的結合情況直接影響抗體的ADCC效應功能,可以通過增強抗體與Fc受體(如FcγRIIIa)的結合能力,進而增強ADCC效應,增強抗體臨床治療效果。

    而抗體分子在重鏈297位天冬酰胺(Asn297)上存N-糖基化位點,Asn297處的糖修飾結構調節了抗體Fc結構域與Fc受體結合的構象狀態。早在近20年前,研究發現去除或降低N-糖上核心巖藻糖后(如圖2),治療性抗體(如抗CD20抗體[9,10]、抗Her2抗體[11]、抗EGFR抗體[12]、抗CCR4抗體[13]等)有更強的與FcγRIIIa的親和力、更強的ADCC活性,并在動物體內或臨床表現出更好的療效。

    目前,2種無巖藻糖修飾的單克隆抗體已被FDA批準用于癌癥治療。[9]


    圖2. 巖藻糖與ADCC活性關系示意圖[14]


    四、去巖藻糖化的成功案例

    日本麒麟制藥公司利用同源重組技術對CHO細胞中的α-1,6巖藻糖轉移酶(FUT8)進行基因干擾,得到了三株能夠用于工業生產完全無巖藻糖抗體的CHO細胞株,其表達的抗CD20抗體相對于野生型抗體來說,ADCC效應提高100多倍。

    2012年3月,日本麒麟制藥公司的Mogamulizumab在日本批準上市,這是第一個上市的糖蛋白工程抗體,在治療性抗體領域具有里程碑的意義。Mogamulizumab是靶向CC趨化因子受體4(CCR4)的人源化單克隆抗體(mAb),而CCR4經常表達于包括皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)在內的某些血液惡性腫瘤細胞。協和麒麟通過降低mogamulizumab的糖鏈結構中的巖藻糖成分,增強了ADCC效應,對惡性血液疾病進行治療。2020年,Mogamulizumab的全球銷售額仍達到1.26億美元。

    第二個被FDA批準上市的無巖藻糖修飾的單克隆抗體是羅氏的obinutuzumab,這是第二代anti-CD20單抗,在抗體制備的過程中過表達N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶3和高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅱ,去除了50%的鹽藻糖修飾,從而降低抗體巖藻糖的含量,進而增強ADCC效應。與第一代產品利妥昔單抗相比,第二代產品obinutuzumab對人FcγRIII的親和力較第一代高50倍,其對表達CD20的淋巴瘤細胞系的ADCC效應增加了10-100倍,在臨床上也體現了治療的優越性。2020年,obinutuzumab全球銷售額約7.24億美元。

    五、昭衍生物平臺優勢

    昭衍生物在自主知識產權的CHO-K1基礎上進行巖藻糖敲除,獲得了完全無巖藻糖的宿主細胞,通過抗體表征及功能驗證,得到了完全無巖藻糖的可應用于工業生產的細胞株CHO-K1-TGZ。

    抗體表達驗證:利用3個不同靶點轉染CHO-K1-TGZ進行抗體表達及功能測試(圖3),通過minipool轉染及篩選,補料流加培養,細胞培養14天后細胞活率仍大于90%,平均產量為3.88g/L。


    圖3. CHO-K1-TGZ表達抗體細胞生長曲線及產量比較


    抗體親和力測定:利用Biacore檢測抗體與抗原FcγRIIIa親和力,結果見圖4,通過結合和解離曲線顯示,去巖藻糖基化的宿主細胞(CHO-K1-TGZ)表達的抗體較野生型CHO細胞(CHO-K1)表達的抗體與FcγRIIIa結合的親和力提高了約6倍。


    圖4. 表達抗體與FcγRIIIa (V176)親和力測定


    抗體ADCC活性驗證:ADCC檢測由去巖藻糖基化的宿主細胞(CHO-K1-TGZ)表達的抗體(SF4)和野生型CHO細胞(CHO-K1)表達的抗體(對照)對靶細胞的ADCC效應進行比較, 結果顯示由去巖藻糖基化的宿主細胞表達的抗體相對于野生型CHO細胞表達的抗體介導的NK細胞對靶細胞的殺傷具有明顯提高,其ADCC EC50值提高了約43倍(圖5)。


    圖5. 表達抗體ADCC活性測定


    抗體糖型鑒定:所得抗體經PNGase F處理,獲得游離的N-糖鏈;2-AB衍生標記后經親水作用色譜分離-熒光和質譜檢測(HILIC-FLR-MS/MS),圖6所示,通過去巖藻糖基化的宿主細胞(CHO-K1-TGZ)表達的抗體未發現含有巖藻糖的N-糖鏈,巖藻糖被完全敲除;此外主要糖型皆為常見的IgG糖型:G0、G1、G2,不含免疫厡性的糖型、復雜糖型以及高甘露糖糖型。 


    圖6. 表達抗體糖型鑒定


    隨著抗體類藥物在市場上占有舉足輕重的地位,細胞工程研究也有了更加廣泛的應用。日本已經上市了無巖藻糖抗體,并且有越來越多的無巖藻糖抗體應用于臨床研究中。因此,構建可以產生此抗體的細胞株具有很高的實用價值。昭衍生物擁有自主知識產權的巖藻糖敲除宿主細胞株(CHO-K1-TGZ),已成功應用于抗體藥物生產,使抗體藥效得以大幅提升。




    參考資料:


    1,藥渡數據庫.
    2,Nitin Agarwal etal; N-Glycosylation of IgG and IgG-Like Recombinant Therapeutic Proteins: Why Is It Important and How Can We Control It? ; Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2020. 11:13.1-13.28.
    3,藥融云數據;最高漲237% | 抗腫瘤藥銷售Top10公布(附名單).
    4,Lewis, G. D. et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 37, 255-263 (1993).
    5,Musolino, A. et al. Immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms and clinical efficacy of trastuzumab-based therapy in patients with HER-2/neu-positive metastatic breast cancer. J Clin Oncol 26, 1789-1796, doi:10.1200/JCO.8957 (2008).
    6,Cartron, G. et al. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood 99, 754-758 (2002).
    7,Weng, W. K. & Levy, R. Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol 21, 3940-3947, doi:10.1200/JCO.2003.013 (2003).
    8,Anolik, J. H. et al. The relationship of FcgammaRIIIa genotype to degree of B cell depletion by rituximab in the treatment of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 48, 455-459, doi:10.1002/art.10764 (2003).
    9,Shinkawa, T. et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of biological chemistry 278, 3466-3473, doi:10.1074/jbc.M210665200 (2003).
    10,Shibata-Koyama, M. et al. Nonfucosylated rituximab potentiates human neutrophil phagocytosis through its high binding for FcgammaRIIIb and MHC class II expression on the phagocytotic neutrophils. Experimental hematology 37, 309-321, doi:10.1016/j.exphem.2008.11.006 (2009).
    11,Junttila, T. T. et al. Superior in vivo efficacy of afucosylated trastuzumab in the treatment of HER2-amplified breast cancer. Cancer research 70, 4481-4489, doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-3704 (2010).
    12,Oppenheim, D. E. et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. British journal of cancer 110, 1221-1227, doi:10.1038/bjc.2014.35 (2014).
    13,Beck, A. & Reichert, J. M. Marketing approval of mogamulizumab: a triumph for glyco-engineering. mAbs 4, 419-425, doi:10.4161/mabs.20996 (2012).
    14,Satoh, M., Iida, S. & Shitara, K. Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Expert opinion on biological therapy 6, 1161-1173, doi:10.1517/14712598.6.11.1161 (2006).



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